Nous développerons des systèmes qui nous permettent de suivre, sur les cellules inflammatoires (monocytes/macrophages et les PMNs) et les ostéoblastes, le trafic des ions libres et des protéines couplés à plusieurs fluorochromes quasi simultanément en combinant la technique de microscopie optique de type FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) et l’imagerie de cellules vivantes en microscopie 4D. Cette technique nous permettra d’atteindre des vitesses d’acquisition d’images requises pour le suivi dynamique de différents marqueurs ioniques et protéiques pour étudier en temps réel, les interactions spécifiques protéines/inhibiteurs régulant l’activité de NF-B liée à l’inflammation tissulaire. Le but est de suivre dans le temps et dans l’espace l’évolution de ces acteurs afin de mieux comprendre leurs fonctions spatio-temporelles dans la résolution de l’inflammation du tissu osseux.
Les cibles étudiées :
3.7 Dynamiques ioniques et moléculaires.
Dynamiques ioniques et moléculaires.L’identification des cibles moléculaires réprimées et/ou surexprimées par l’activation de NF-B (liée à l’activité des kinases IKK1/2 et NEMO) en interaction avec la [Ca2+]i et le rapport [K+]/[Na+] intracellulaire dans la réponse inflammatoire seront abordées par des méthodes de microscopies optiques à fluorescence confocale. Des approches de transfections cellulaires transitoires (siRNAs ciblés sur NF-kB) et pharmacologiques y seront également réalisées en bloquant, soit l’entrée des ions Ca2+, Na+ et K+ par l’utilisation d’inhibiteurs chimiques spécifiques, soit en bloquant l’activité de NF-B par des peptides inhibiteurs.
L’approche simultanée in situ de la dynamique d’activation de NF-B en relation avec la [Ca2+]i et le rapport [K+]/[Na+] intracellulaire sera réalisée à l’échelle de la cellule vivante par des méthodes de microscopies optiques à fluorescence confocale en 4D (qui sont adaptées pour le FRET) que nous avons récemment développées sur les plate-formes « Plateaux Imagerie Cellulaire et Imagerie in vivo , microTEP » de l’Inserm UMR-S 719, Hôpital St-Antoine et de l’IFR 65, St-Antoine, Paris. Ces techniques seront transférées sur le plateau vidéo-microscopique de l’IFR53 de Reims.
La complémentarité de ces méthodes d’analyses de la [Ca2+]i et du rapport [K+]/[Na+] intracellulaire alliant les microscopies optiques confocales et électroniques (microspectrométries X et EELS), applicables in situ sur nos modèles cellulaires et tissulaires normaux et pathologiques, permettra de progresser très rapidement dans la compréhension des rôles respectifs des ions Ca2+, Na+ et K+ dans la génèse de l’inflammation aiguë et chronique du tissu osseux.